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Teilpartie: Bestimmter Teil einer großen Partie, der dem Probenahmeverfahren zu unterziehen ist. Jede Teilpartie muss physisch getrennt und identifizierbar sein.

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Einzelprobe: An einer einzigen Stelle der Partie bzw. Teilpartie entnommene Probenmenge.

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Sammelprobe: Summe der einer Partie oder Teilpartie entnommenen Einzelproben.

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Laborprobe: Für das Labor bestimmte(r) repräsentative(r) Teil/Menge der Sammelprobe.

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Falls die Partie, der die Proben entnommen werden sollen, kleine Fische enthält (einzelne Fische < 1 kg), werden ganze Fische zur Herstellung der Sammelprobe verwendet. Falls die sich daraus ergebende Sammelprobe über 3 kg wiegt, können die Einzelproben aus dem mittleren Teil (jeweils mindestens 100 g schwer) der Fische bestehen, die die Sammelprobe bilden. Die Gesamtmenge, für die der Höchstgehalt gilt, wird zur Homogenisierung der Probe verwendet.

Der mittlere Teil befindet sich im Schwerpunkt der Fische, in der Regel im Bereich der Rückenflosse (sofern vorhanden) oder in der Mitte zwischen Kiemenöffnung und Darmausgang.

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Falls die Partie, der die Probe entnommen werden soll, größere Fische enthält (einzelne Fische mit einem Gewicht von mehr als 1 kg), besteht die Einzelprobe aus dem mittleren Teil des Fisches. Jede Einzelprobe wiegt mindestens 100 g.

Bei Fischen mittlerer Größe (1 bis 6 kg) wird die Einzelprobe vom Mittelteil als Scheibe im Querschnitt entnommen.

Bei sehr großen Fischen ( > 6 kg) wird die Einzelprobe im Mittelteil rechtsseitig (von vorne gesehen) aus dem Muskelfleisch der Rückenpartie entnommen. Würde die Entnahme eines Stückes aus dem mittleren Teil des Fisches einen beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden nach sich ziehen, kann die Entnahme von drei Einzelproben von jeweils mindestens 350 g als ausreichend angesehen werden, unabhängig von der Größe der Partie. Alternativ dazu kann für die Einzelprobe, die für den Dioxingehalt in dem Fisch insgesamt repräsentativ ist, auch ein gleich großer Teil aus Muskelfleisch im Schwanz- oder Kopfbereich entnommen werden.

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Es gelten die Bestimmungen von Ziffer 4.3 für die Probenzusammensetzung.

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Tritt in der Partie eine Kategorie von Größe/Gewicht vorherrschend auf (Anteil von 80 % oder mehr), wird die Probe von Fischen dieser Kategorie genommen. Diese Probe gilt dann als repräsentativ für die ganze Partie.

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Andernfalls muss sichergestellt sein, dass die für die Beprobung ausgewählten Fische repräsentativ für die Sendung sind. Weitere Hinweise für solche Fälle werden in dem Leitfaden „Guidance document for the sampling of lots of fish containing whole fishes of different size and/or weight“ (2) gegeben.

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durch Berechnung der erweiterten Ungenauigkeit unter Verwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, was ein Vertrauensniveau von etwa 95 % ergibt. Eine Partie oder Teilpartie ist zu beanstanden, wenn der gemessene Wert minus U über dem zulässigen Wert liegt. Bei einer getrennten Bestimmung von Dioxinen und dioxinähnlichen PCB ist die Summe der geschätzten erweiterten Ungenauigkeit der getrennten Analyseergebnisse der Dioxine und dioxinähnlichen PCB für die Summe der Dioxine und dioxinähnlichen PCB anzulegen;

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durch Bestimmung der Entscheidungsgrenze (CCα) gemäß den Bestimmungen der Entscheidung 2002/657/EG der Kommission vom 12. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen (5) (Ziffer 3.1.2.5 des Anhangs — Fall von Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert). Eine Partie oder Teilpartie ist zu beanstanden, wenn der gemessene Wert gleich CCα ist oder diesen Wert übersteigt.

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In jeder Stufe des Probenahme- und Analyseverfahrens sind Maßnahmen zu treffen, um jegliche Kreuzkontamination zu vermeiden.

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Die Proben sind in Glas-, Aluminium-, Polypropylen- oder Polyethylen-Behältern zu lagern und zu transportieren. Spuren von Papierstaub sind vom Probenbehälter zu entfernen. Gläser sind mit Lösungsmitteln auszuspülen, die nachweislich frei von Dioxinen sind oder zuvor auf Vorhandensein von Dioxinen überprüft wurden.

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Lagerung und Transport der Proben haben so zu erfolgen, dass die Einheit der Lebensmittelprobe erhalten bleibt.

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Sofern zutreffend, sind die einzelnen Laborproben mithilfe eines Verfahrens fein zu mahlen und gründlich zu mischen, mit dem nachweislich eine vollständige Homogenisierung erreicht wird (z. B. so fein gemahlen, dass die Probe durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm passt); falls die Feuchtigkeit zu hoch ist, sind die Proben vor der Mahlung zu trocknen.

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Es ist eine Blinduntersuchung durchzuführen, indem das gesamte Untersuchungsverfahren durchgeführt und nur die Probe dabei weggelassen wird.

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Das Gewicht der für die Extraktion verwendeten Probe muss ausreichend groß sein, um die Anforderungen an die Messempfindlichkeit zu erfüllen.

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Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die zu untersuchenden Erzeugnisse sind gemäß international anerkannten Leitlinien zu validieren.

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Bei Fischen ist die Haut zu entfernen, da sich der Höchstgehalt auf das Muskelfleisch ohne Haut bezieht. Reste von Muskelfleisch und Fettgewebe sind jedoch sorgfältig vollständig von der Innenseite der Haut abzuschaben und der zu untersuchenden Probe beizufügen.

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Die Laboratorien haben den Nachweis der Leistungsfähigkeit eines Verfahrens im Bereich der interessierenden Konzentration, z. B. 0,5 x, 1 x und 2 x die interessierende Konzentration mit einem akzeptablen Abweichungskoeffizienten für wiederholte Untersuchung, zu führen. Näheres zu den Akzeptanzkriterien siehe Abschnitt 5.

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Die Bestimmungsgrenze liegt beim Bestätigungsverfahren im Bereich von etwa einem Fünftel der interessierenden Konzentration.

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Als interne Qualitätssicherungsmaßnahmen sollten regelmäßige Blindkontrollen und Experimente mit aufgestockten Proben oder Untersuchungen von Kontrollproben (sofern erhältlich, vorzugsweise zertifiziertes Referenzmaterial) durchgeführt werden.

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Die Laborleistung ist durch die kontinuierliche erfolgreiche Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zur Ermittlung des Gehalts an Dioxin und dioxinähnlichen PCB in den entsprechenden Futtermittel-/Lebensmittelmatrizen unter Beweis zu stellen.

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Gemäß den Bestimmungen der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 müssen die Laboratorien von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein, die nach ISO Guide 58 arbeitet, damit sichergestellt ist, dass die Labore bei der Untersuchung Qualitätssicherungsverfahren anwenden. Die Laboratorien sollten gemäß der Norm ISO/IEC/17025 akkreditiert sein.

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Große Messempfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenze. Bei PCDD und PCDF müssen die nachweisbaren Mengen wegen der extrem hohen Toxizität einiger dieser Verbindungen im Bereich Pikogramm TEQ (10-12 g) liegen. Der Gehalt an PCB ist bekanntlich höher als derjenige an PCDD und PCDF. Bei den meisten PCB-Kongeneren ist eine Messempfindlichkeit im Bereich Nanogramm (10-9 g) bereits ausreichend. Zur Messung der toxischeren dioxinähnlichen PCB-Kongenere (insbesondere der non-orthosubstituierten Kongenere) muss jedoch die gleiche Messempfindlichkeit erreicht werden wie für die PCDD und PCDF.

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Hohe Selektivität (Spezifizität). PCDD, PCDF und dioxinähnliche PCB müssen von einer Vielzahl anderer, gemeinsam extrahierter und möglicherweise interferierender Verbindungen unterschieden werden, die in Konzentrationen von bis zu mehreren Größenordnungen höher als diejenigen der zu prüfenden Analyten vorhanden sind. Bei Gaschromatografie-Massenspektrometrie-(GC/MS-)Verfahren ist eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Kongeneren erforderlich, wie z. B. zwischen toxischen Kongeneren (z. B. die siebzehn 2,3,7,8-substituierten PCDD und PCDF sowie dioxinähnliche PCB) und anderen Kongeneren. Bioassays müssen eine selektive Bestimmung der TEQ-Werte als Summe aus PCDD, PCDF und dioxinähnlichen PCB ermöglichen.

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Hohe Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision). Die Bestimmung sollte eine valide Schätzung der tatsächlichen Konzentration in einer Probe ermöglichen. Hohe Genauigkeit (Messgenauigkeit: der Grad der Übereinstimmung zwischen dem Ergebnis einer Messung und dem wahren oder ermittelten Wert der Messgröße) ist notwendig, damit die Zurückweisung des Ergebnisses einer Probenuntersuchung aufgrund der geringen Zuverlässigkeit der TEQ-Schätzung vermieden wird. Die Genauigkeit des Analyseverfahrens wird angegeben durch die Richtigkeit (Differenz zwischen dem gemessenen Mittelwert eines Analyten in einem zertifizierten Material und seinem zertifizierten Wert, ausgedrückt als Prozentsatz dieses Wertes) und der Präzision (RSDR, Relative Standardabweichung, berechnet aus unter Reproduzierbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen).

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Die Addition von 13C-markierten 2,3,7,8-chlorsubstituierten internen PCDD/F-Standards (und 13C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards, sofern dioxinähnliche PCB zu bestimmen sind) ist ganz zu Anfang des Untersuchungsverfahrens, z. B. vor der Extraktion, durchzuführen, damit das Analyseverfahren validiert werden kann. Bei jeder der tetra- bis octa-chlorierten homologen Gruppen von PCDD/F (und bei jeder der homologen Gruppen von dioxinähnlichen PCB, sofern dioxinähnliche PCB zu bestimmen sind) muss mindestens ein Kongener zugegeben werden (alternativ dazu mindestens ein Kongener je massenspektrometrisch ausgewählter Ionenaufzeichnungsfunktion zur Überwachung von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB). Im Fall der Bestätigungsverfahren ist die Verwendung aller 17 13C-markierten 2,3,7,8-substituierten internen PCDD/F-Standards und aller 12 13C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards eindeutig vorzuziehen.

Die relativen Responsefaktoren sollten mittels geeigneter Kalibrierlösungen auch für diejenigen Kongenere bestimmt werden, bei denen kein 13C-markiertes Analogon zugegeben wurde.

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Bei Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs und Lebensmitteln tierischen Ursprungs, die weniger als 10 % Fett enthalten, ist die Addition der internen Standards vor der Extraktion obligatorisch. Bei Lebensmitteln tierischen Ursprungs, die mehr als 10 % Fett enthalten, können die internen Standards entweder vor der Extraktion oder nach der Fettextraktion addiert werden. Die Extraktionseffizienz sollte auf geeignete Weise validiert werden, je nachdem, auf welcher Stufe die internen Standards zugegeben und ob die Ergebnisse auf Produkt- oder Fettbasis angegeben werden.

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Vor der GC/MS-Analyse sind 1 oder 2 Wiederfindungs-(Surrogat-)Standards zuzufügen.

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Es ist eine Kontrolle der Wiederfindungsrate erforderlich. Bei Bestätigungsverfahren sollten die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards zwischen 60 und 120 % liegen. Geringere oder höhere Wiederfindungsraten für einzelne Kongenere, insbesondere für einige hepta- und octachlorierte Dibenzodioxine und Dibenzofurane, können unter der Bedingung akzeptiert werden, dass ihr Beitrag zum TEQ-Wert 10 % des gesamten TEQ-Wertes (gestützt auf die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) nicht übersteigt. Bei Screening-Verfahren sollten die Wiederfindungen zwischen 30 und 140 % liegen.

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Die Dioxine sind von interferierenden chlorierten Verbindungen, wie z. B. nicht dioxinähnlichen PCB und chlorierten Diphenylethern, mittels geeigneter chromatografischer Verfahren abzutrennen (vorzugsweise mit Florisil-, Aluminiumoxid- und/oder Aktivkohlesäule).

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Die gaschromatografische Auftrennung der Isomere muss ausreichend sein (< 25 % von Peak zu Peak zwischen 1,2,3,4,7,8-HxCDF und 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

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Die Bestimmung sollte nach der EPA-Methode 1613 Revision B („Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS“) oder nach einer anderen Methode mit gleichwertigen Leistungskriterien erfolgen.

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Bei Lebensmitteln mit einer Dioxinkontamination von etwa 1 pg WHO-TEQ/g Fett sollte die Differenz zwischen Ober- und Untergrenze nicht mehr als 20 % (gestützt auf die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) betragen. Bei Lebensmitteln mit geringem Fettgehalt sind die gleichen Anforderungen bei einer Kontamination von etwa 1 pg WHO-TEQ/g Erzeugnis anzuwenden. Bei einer geringeren Kontamination, wie z. B. 0,50 pg WHO-TEQ/g Erzeugnis, kann die Differenz zwischen Ober- und Untergrenze im Bereich zwischen 25 und 40 % liegen.

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Bei jeder Testreihe ist eine Blind- und eine Referenzprobe einzubeziehen, die zur gleichen Zeit und zu den gleichen Bedingungen extrahiert und untersucht werden. Die Referenzprobe muss im Vergleich zu einer Blindprobe ein deutlich erhöhtes Messsignal aufweisen.

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Zusätzliche Referenzproben von 0,5 x und 2 x die interessierende Konzentration sind einzubeziehen, damit die ordnungsgemäße Durchführung des Tests in dem für die Kontrolle der interessierenden Konzentration relevanten Bereich nachgewiesen werden kann.

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Bei der Untersuchung anderer Matrizen ist die Eignung der Referenzproben nachzuweisen, vorzugsweise durch die Aufnahme von Proben, bei denen sich durch HRGC/HRMS ein TEQ-Gehalt vergleichbar mit dem der Referenzprobe ergeben hat, oder andernfalls von einer Blindprobe, die bis zu dieser Höhe aufgestockt wurde.

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Da in Bioassays keine internen Standards verwendet werden können, sind Wiederholbarkeitstests zur Information über die Standardabweichung innerhalb einer Testreihe sehr wichtig. Die relative Standardabweichung sollte unter 30 % liegen.

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Bei Bioassays sind die zu bestimmenden Analyten, mögliche auftretende Störungen und der akzeptable, maximale Blindwert zu bestimmen bzw. festzulegen.

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Zum Screening können GC/MS-Verfahren und Bioassays verwendet werden. Bei GC/MS-Verfahren sind die unter Ziffer 6 festgelegten Anforderungen heranzuziehen. Spezielle Anforderungen gibt es für zellbasierte Bioassays und Kit-basierte Bioassays unter Ziffer 7.3 bzw. Ziffer 7.4 dieses Anhangs.

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Es sind Informationen über die Anzahl falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse eines großen Probensatzes unterhalb und oberhalb der Höchstgehalte oder der Auslösewerte im Vergleich zum TEQ-Gehalt erforderlich, der durch ein Bestätigungsverfahren bestimmt wurde. Der tatsächliche Anteil der falsch negativen Ergebnisse muss unter 1 % liegen. Der Anteil der falsch positiven Proben muss so gering sein, dass ein Screening Vorteile hat.

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Positive Ergebnisse sind immer durch ein Bestätigungsverfahren abzusichern (HRGC/HRMS). Außerdem sind die Proben aus einem großen TEQ-Bereich durch HRGC/HRMS (ca. 2-10 % der negativen Proben) zu bestätigen. Informationen über Entsprechungen von Bioassays und HRGC/HRMS-Ergebnissen sind zur Verfügung zu stellen.

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Für jeden Testlauf in einem Bioassay ist eine Referenzkonzentrationsreihe von TCDD oder einem Gemisch aus Dioxinen/Furanen/dioxinähnlichen PCB (vollständige Dosis-Response-Kurve mit R2 > 0,95) erforderlich. Beim Screening kann eine erweiterte Kurve im Niedrigkonzentrationsbereich zur Untersuchung von Proben im Niedriggehaltbereich verwendet werden.

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Zum Beleg der Richtigkeit der Ergebnisse des Bioassays über einen konstanten Zeitraum hinweg ist eine TCDD-Referenzkonzentration (etwa 3 x die Quantifizierungsgrenze) auf einem Qualitätskontrollblatt zu verwenden. Eine Alternative dazu wäre die relative Response einer Referenzprobe im Vergleich zur TCDD-Kalibrierungslinie, da die Response der Zellen von vielen Faktoren abhängen kann.

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Für jede Art von Referenzmaterial sind Qualitätskontroll-Charts anzufertigen und zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass das Ergebnis mit den Leitlinien übereinstimmt.

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Insbesondere bei quantitativen Berechnungen muss die Verdünnung der Proben so gewählt werden, dass die Messwerte innerhalb des linearen Teils der Response-Kurve des Bioassays liegen. Über dem linearen Teil der Response-Kurve liegende Proben sind zu verdünnen und neu zu testen. Aus diesem Grund sind immer mindestens drei oder mehr Verdünnungen einer Probe zur gleichen Zeit zu testen.

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Die Standardabweichung sollte bei einer dreifachen Bestimmung einer Probenlösung nicht mehr als 15 % betragen und zwischen drei unabhängigen Versuchen nicht mehr als 30 %.

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Die Nachweisgrenze kann auf 3 x die Standardabweichung der Blindlösung oder der Hintergrund-Response festgelegt werden. Eine andere Möglichkeit wäre, auf die Gleichung der Kalibrierungskurve eine über dem Hintergrund liegenden Messwert anzuwenden (Mindestsignal: 5 x der Blindwert des Lösungsmittels), der anhand der Kalibrierungskurve des Tages berechnet wird. Die Bestimmungsgrenze kann auf 5 bis 6 x die Standardabweichung der Blindlösung oder des Hintergrundsignals festgelegt werden, oder es kann ein Signal über dem Hintergrund (Induktionsfaktor 10 x der Blindwert des Lösungsmittels) angewandt werden, der anhand der Kalibrierungskurve des Tags berechnet wird.

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Es muss sichergestellt werden, dass die Kit-basierten Bioassays ausreichend sensitiv und verlässlich für Lebensmittel sind.

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Bei der Vorbereitung und Untersuchung der Proben sind die Anweisungen des Herstellers zu beachten.

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Testkits, deren Haltbarkeitsdatum abgelaufen ist, dürfen nicht mehr verwendet werden.

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Materialien oder Bestandteile, die zur Verwendung mit anderen Kits bestimmt sind, dürfen nicht verwendet werden.

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Die Testkits sollten bei der angegebenen Lagertemperatur aufbewahrt und bei der angegebenen Betriebstemperatur verwendet werden.

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Die Nachweisgrenze für Immunoassays wird bestimmt als Summe aus dem Mittelwert und der 3-fachen Standardabweichung von 10 Untersuchungen des Blindwerts, dividiert durch den Steigungsbeitrag der linearen Regressionsgleichung.

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Für die Labortests sollten Referenzstandards verwendet werden, damit sichergestellt ist, dass das Messsignal des Standards im Test innerhalb eines akzeptablen Bereichs liegt.